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Evaluación de la técnica reacción de la cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de Campylobacter jejuni en muestras de carne fresca de pollo
(Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, 2024) Chacolla Mena, Zulema; Vasquez Michel, Aneth, asesora
El género Campylobacter es reportado con más frecuencia en enfermedades transmitidas por alimentos, y entre estos microorganismos Campylobacter jejuni es el más aislado. Es importante conocer en nuestro medio la contaminación de alimentos con este agente siendo de importancia en salud pública. Existen métodos alternativos, rápidos y sensibles para la detección e identificación de patógenos bacterianos en alimentos. Las propiedades microbiológicas de Campylobacter jejuni hacen que su aislamiento sea difícil y lento. Por lo tanto, es necesario implementar métodos alternativos de diagnóstico que sean sensibles y específicos que brinden resultados oportunos para la toma de acciones preventivas relacionadas con la contaminación de alimentos por Campylobacter. La detección de este patógeno aplicando PCR convencional permitió evaluar la técnica molecular y de esta manera coadyuvó con la generación de información sobre la contaminación de la carne de pollo con este agente relacionado con los procesos de manipulación. El objetivo del presente estudio fue evaluar la técnica molecular de PCR convencional para detección de Campylobacter jejuni en carne fresca de pollo, utilizando un caldo de enriquecimiento, optimizando el tiempo de análisis y proporcionando una técnica rápida, sensible y confiable. Se analizaron 72 muestras de carne cruda de pollo, utilizando caldo de enriquecimiento preston a partir del cual se realizó la extracción del ADN mediante la elección del kit de extracción de lisis por columna y cuyo producto fue utilizado para su amplificación por PCR convencional, posterior revelado con SYBR Green en gel de agarosa, obteniendo los resultados de la evaluación que reflejaron: sensibilidad 98%, especificidad 75%, exactitud 93%, LR(+): 3,94 y LR(-): 0.03. Por tanto, señalamos que la comparación entre análisis microbiológico con PCRc es satisfactorio, esta técnica reduce en gran medida el tiempo total para detectar Campylobacter jejuni en carne fresca de pollo y se constituye en un modelo importante para detectar otros patógenos en otras matrices de alimentos.
Optimización del uso de la técnica de western blot como herramienta inmunoproteómica, para la identificación de proteínas antigénicas con fines de diagnóstico de cisticercosis
(Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, 2024) Machaca, Melissa Carmen; Vasquez Michel, Aneth, asesora
La cisticercosis es una enfermedad zoonótica desatendida, causada por Taenia solium y transmitida por la ingestión de los huevos del parásito, causando daño al tejido muscular (cisticercosis) y posteriormente al cerebro (neurocisticercosis). (Chile, 2020) El método que se emplea para el diagnóstico de la cisticercosis es el ELISA (Ensayo Inmunoadsorbente unido a enzima), el cual tiene sensibilidad relativamente baja, por lo que el diagnóstico del paciente debe ser confirmado por Western blot o por las pruebas imagenológicas, tomografía axial computarizada y resonancia magnética nuclear. (Oswgladys & Ferrer, 2016). Según la OPS/OMS (2018) la prueba serológica comercial no presenta una especificidad y sensibilidad suficiente para el diagnóstico de cisticercosis debido a la reacción cruzada que presenta con otros parásitos. La situación actual de Bolivia con respecto a la cisticercosis no está actualizada, sin embargo, es necesario tener en cuenta que la mayor parte de la población no tiene servicios básicos y es uno de los factores causantes de la cisticercosis. Otras causas que podemos mencionar son: falta de control en la crianza de porcinos, la presencia de mataderos clandestinos y la venta de carne de cerdo de dudosa procedencia. El objetivo del presente estudio es optimizar el uso de la técnica de Western blot, para el estudio de proteínas antigénicas nativas. Para el presente trabajo se obtuvo un cerdo infectado con cisticercos de Taenia solium, que fue faenado. Procedente de la región de Batallas, ubicada en la Provincia Los Andes del departamento de La Paz. La obtención de la muestra y la parte experimental se realizó en el Instituto SELADIS, en un ambiente adecuado para evitar la contaminación de las muestras. Posteriormente, se efectuó la cuantificación de proteínas por el método de Bradford, para conocer la concentración de las mismas. Luego se emplearon métodos para solubilizar, disgregar, desnaturalizar y reducir las proteínas, con la finalidad de obtener las proteínas antigénicas por sus puntos isoeléctricos por electroforesis bidimensional y sus pesos moleculares a través de la electroforesis vertical. Dichas proteínas antigénicas, presentes en el gel, se transfirieron al equipo de Western blot, en una membrana de nitrocelulosa y finalmente se conjugaron con los anticuerpos de pacientes positivos a cisticercosis diagnosticados por ELISA. Entre los resultados obtenidos, se encontró que el líquido vesicular presentó 30 proteínas, de las cuales 5 fueron seleccionadas por presentar reactividad con los sueros positivos para cisticercosis.
Validación de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qpcr) acoplada a curvas melting como herramienta alternativa para el diagnóstico de tuberculosis multidrogorresistente
(Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, 2019) Mercado Michel, Brayan Gabriel; Vasquez Michel, Aneth, asesora
La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa, causada por diversas especies del Complejo Mycobacterium tuberculosis, actualmente se estima que un tercio de la población mundial se encuentra afectada por lo que representa una amenaza para la salud pública, principalmente por el surgimiento de cepas Multidrogorresistentes (TB-MDR). En Bolivia en la gestión 2017, en Bolivia se reportaron 7.538 personas enfermas con Tuberculosis, y los últimos datos sobre TB-MDR indican un aumento de 0,2% por año, el año 2012 se registró un 3,1% de TB-MDR. Actualidad en nuestro país se emplean métodos moleculares para la identificación de este agente infeccioso; no obstante, existen muy pocos o ningún trabajo acerca de la aplicación de métodos moleculares para la detección precisa y efectiva de cepas TB-MDR que otorguen validez a los resultados emitidos. Este trabajo resuelve el cuestionamiento de si la PCR en tiempo real (RT-qPCR) acoplada a curvas melting es una herramienta de diagnóstico alternativo aplicable y confiable, para la identificación de tuberculosis multidrogorresistente. Se trabajó con 74 cepas de Mycobaterium tuberculosis fenotípicamente identificadas por cultivo (método de las proporciones, Canetti Rist). El material genético se obtuvo por columnas, por ser el que mejores resultados presentó en el desarrollo de la PCR. Se utilizaron dos controles primarios del método para la determinación de resistencia a Isoniacida y Rifampicina, tanto los controles como las muestras se procesaron por RT-qPCR acoplada a curvas melting, mediante cambios de temperatura de disociación. Los resultados de la validación reflejaron: sensibilidad: 67.4%, especificidad: 83.3%, exactitud: 73.97%, VPP: 85.3%, VPN: 64.1%, LR(+): 4.18 y LR(-): 0.38 para Isoniacida, mientras que para Rifampicina: Sensibilidad: 97%, especificidad: 20%, exactitud: 58.9%, VPP: 55.4%, VPN: 87.5%, LR(+): 1,21 y LR(-): 0.10. El método evaluado para la determinación de resistencia a Isoniacida presenta un equilibrio bueno entre sensibilidad y especificidad, por lo que representa una alternativa diagnóstica confiable, mientras que el método evaluado para resistencia a Rifampicina presenta una alta sensibilidad que es muy útil para países endémicos como es Bolivia.