Método fluorométrico para identificar agentes naturales citotóxicos y su aplicación en la evaluación de agentes antiparasitarios selectivos

Abstract

El ministerio de salud tiene como una de las prioridades en investigación a las enfermedades infecciosas, entre las que incluye a las leishmaniasis y la tripanosomiasis americana. En la Facultad Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas se estudian especies vegetales medicinales utilizadas por la cultura Tacana como fuente de agentes antiparasitarios potenciales. Los laboratorios dedicados al descubrimiento de moléculas naturales con actividad antiparasitaria, tienen el desafío de desarrollar protocolos que permitan detectar biomoléculas selectivas, efectivas y menos tóxicas que las disponibles. Por ende, las evaluaciones antiparasitarias in vitro (CI50), deberían ir acompañadas de evaluaciones de citotoxicidad (DL50), con el fin de calcular un Índice de Selectividad (IS=DL50 / Cl50 como parámetro de especificidad biológica. La citotoxicidad fue medida sobre líneas de macrófagos (RAW 264.7, murino), células involucradas en las infecciones por parásitos intracelulares. El protocolo fluorométrico parte con una población de 5x10(4) células/ mL, incubada a 37°C en DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's médium), por 96 horas, con adición de resazurina (2mM) 3 horas antes de las lecturas finales. Bajo estas condiciones se evaluó la citotoxicidad de drogas control y 15 extractos vegetales seleccionados por su actividad anti-kinetoplastida. El extracto de Cosmailu fue el más citotóxi-co, Ejije bid'u resultó selectivo para T. cruzi y Leishmania amazonensis, mientras que Id'ene eidhue, fue selectivo para L. amazonensis. Finalmente, los otros 12 extractos resultaron ser poco selectivos o citotóxicos.

The Ministry of Health has infectious diseases as one of the research priorities, including leishmaniasis and American try-panosomiasis. The Faculty of Pharmaceuti-cal and Biochemical Sciences develops eval-uations of medicinal plant species used by the Tacana culture as a source of potential antiparasitic agents. Laboratories dedicated to the discovery of natural molecules with antiparasitic ac-tivity, have the challenge of developing pro-tocols that allow the detection of selective, effective and less toxic biomolecules than those available. Therefore, in vitro antipar-asitic evaluations (IC50) should be accompa-nied by cytotoxicity evaluations (LD50), in order to calculate a Selectivity Index (IS = LD50 / IC50) as a parameter of biological specificity. The cytotoxicity was measured on mac-rophage line (RAW 264.7, murine), cells en-gaged on intracellular parasites infections. The fluorometric protocol starts with an ini-tial population of 5x10(4)cells/mL, incubated at 37°C, in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) for 96 hours with addition of resazurin (2mM) 3 hours, before final read-ings. Under these conditions the cytotoxicity of control drugs and 15 plant extracts, se-lected by their anti-kinetoplastid activity, was evaluated. Cosumailu extract was the most cytotoxic, Ejije bid'u was selective for T. cruzi, and Leishmania amazonensis, while Id'ene eidhue, was selective for L. amazonensis. Finally, the other 12 extracts were lit-tle selective or cytotoxic.