Optimización de métodos moleculares para la detección de listeria monocytogenes en vegetales frescos mínimamente tratados

Abstract

La Listeriosis es una enfermedad infecciosa con alta tasa de mortalidad, transmitida a través de alimentos contaminados, causada por la bacteria Listeria monocytogenes. Con el advenimiento de las pruebas moleculares se ha visto la necesidad de implementar nuevos métodos de ejecución rápida para la detección y cuantificación de microorganismos presentes en alimentos. El objetivo de este estudio es contar con métodos moleculares optimizados para la detección y cuantificación de Listeria monocytogenes en vegetales frescos mínimamente tratados. Los métodos utilizados fueron PCR-RFLP y qPCR ensayo SYBRGreen I. Se utilizaron cepas ATCC 19111, para la fortificación de muestras y muestras naturalmente contaminadas con el agente objeto de este estudio. En PCR-RFLP con la enzima de restricción XmnI, consiguió dos fragmentos de 770 pb y 120 pb visualizados en geles de agarosa a 2% identificando género/especie y el método (qPCR) ensayo de SYBR Green I, identifica en una misma reacción a la bacteria en estudio con el gen hlyA de 112 pb con una gráfica de amplificación mayor al threshold Ct y un solo pico de amplificación de temperatura de fusión Tm Los resultados de PCR-RFLP y qPCR ensayo SYBRGreen I determino límites de detección de 1870 copias/ul, 187 copias/ul respectivamente, en qPCR con Ct=19,65 a 34,36 y Tm= 72,15ºC. En muestras de vegetales frescos mínimamente tratados tomadas en supermercados y mercados populares se detectó la presencia de Listeria monocytogenes del 20%. La qPCR es altamente sensible en la detección de ADN, constituyéndose en una técnica alternativa complementaria al cultivo, además de ser un método sencillo y generar resultados en tiempos cortos, podrían aplicarse para el análisis de rutina en los laboratorios de análisis de alimentos e incrementar el número de muestras. En conclusión los métodos moleculares son altamente sensibles y específicos