Construcción de un Vector de Virus de Planta Portando una Secuencia Mutagenizada del GEN NEF Del HIV-1

Abstract

Los vectores de virus de plantas representan una alternativa excelente como sistema\nde expresión de proteínas heterólogas, especialmente de biofármacos y vacunas\nmulticomponentes. Diferentes antígenos del HIV-1 han sido expresados exitosamente en\nplantas a través de sistemas de transformación estable o expresión transitoria. Dentro del\ngrupo de proteínas que componen el virión del HIV, Nef es considerada un blanco promisorio\npara la formulación de vacunas debido al papel que desempeña durante los primeros pasos de\nla infección viral. En el presente trabajo se reportan los resultados de la construcción de una\nquimera viral portando una secuencia modificada del gen nef del HIV-1. Se introdujeron dos\nsustituciones puntuales en los sitios reconocidos por las enzimas de restricción XhoI y KpnI\nutilizando la técnica de amplificación por PCR. Con este propósito se emplearon dos cebadores\nmutagénicos y dos silvestres en tres rondas de amplificación por PCR para cada sustitución.\nLos amplicones portadores de la doble mutación fueron ligados al vector de expresión viral\npTMV30B-GFPC3, y se multiplicaron por transformación en células de E. coli XL1-blue; los cuales\nfueron posteriormente purificados y analizados por digestión y secuenciación. Los productos\nde la transcripción in vitro de esta quimera se inocularon en plantas de Nicotiana benthamiana,\ny la infectividad de los transcriptos se validó por sintomatología y RT-PCR. Los resultados\ndemostraron que la quimera viral construida produjo transcriptos infectivos capaces de inducir\nsíntomas característicos en las plantas inoculadas; lo cual abre la posibilidad para desarrollar\nuna vacuna anti-HIV producida en plantas.